流式細胞儀在血液疾病的應用：入門
感謝韓紹民醫師與2020年籌辦工作坊，也感謝林口長庚施宣任醫師的教學，以下為教學與我自己讀書的心得筆記整理。
英文名 Flow Cytometry in Hematological Diseases : An Introduction
在 EuroFlow 引入台灣後，大大地改變了流式細胞儀在台灣臨床的運用。EuroFlow 的資料公佈在網路上，任何人都可以查得到，以下是它的網頁。
https://euroflow.org/protocols/
另外是線上課程可以在 International Society for Advancement of Cytometry (ISAC) 網站 CYTO University 找到。
篩檢流程
如果我們抽了一管血，或是淋巴結檢體，骨髓、胸水、腦脊髓液等體液，送到流式細胞儀的檢驗單位，會走什麼樣的流程。送檢加做要在 48 小時之內，以免 viability 影響判讀結果。
如果懷疑急性血癌的話，會送 ALOT (acute leukemia orientation tube)，懷疑淋巴瘤的話，會送 LST (lymphoma screening tube)，而懷疑漿細胞病變多發性骨髓瘤的話，會送 PCST (Plasma Cell Screening Tube)。
ALOT 會依 Myeloid, T, B cell markers 再分出 AML/MDS, T-ALL, B-ALL。而 LST 則可以分出 B-CLPD (B cell lymphoproliferative disorders)、T-CLPD (T cell lymphoproliferative disorders)，與 NK-CLPD (NK cell lymphoproliferative disorders)。我們會用 lineage markers 來判斷接下來要做 Myeloid、B cell、T cell，還是 NK。
除了 CD 幾負責什麼功能要有印象外，也要記得它們的位置。像是 CD3 分 sCD3 主要在成熟T細胞，而 cyCD3 只要是 T 細胞無論成熟與否都有。
常見參數與名稱
CD：全名叫 cluster of differentiation，細胞表面的蛋白質常見的會被賦予不同編號，比如說 PD-1 是 CD279、CTLA4 是 CD152、CCR7 是 CD197、Leukocyte Antigen (LCA) 是 CD45。
除了看到「CD幾」外，還會看到後面接著一串，像是 FITC、PE、PB、APC、APCH7、KrO、PacB、PacO、PerCP55 等，這些是螢光染劑 Dye conjugates (fluorochrome) 。
Forward scatter (FS)：大小會分 height (FSC-H) 與 area (FSC-A)。
side measure side scatter (SS) : 看細胞顆粒。
Automated population separator (APS)：如果把一個 marker (e.g., CD8) 當作一維的話，多維的分佈投影到二維平面，就是 APS 呈現的原理，有點像 UMap 與 tSNE。原理參見此篇。加入的參數越多，分得越好，如果加入 time 這個參與就會排成一條條的直線（可以不用XD）。開啟 APS 可以大概看出有幾群細胞。
實用的操作原則
先對各血球成熟 (differentiation, maturation) 會出現哪些 CD markers 有概念，才會知道目標血球可能處於哪一個階段。比較可以用理解而不是死背硬記。
機器可以幫忙自動分群 (automated clustering)，之後再用手動修正。有 database 可以參考而且可以自動產出報告，但是要錢，然後操作流程必須要完全參照 SOP。
圈選（Gating）目標細胞除了目標的 CD markers（例：T cell lymphoma 要抓出 CD3、CD7、CD4/8），還是要排除掉非血球細胞（從 CD45 * SSC-A 找出 CD45 negative 分到非血球）、排除死細胞（FSC-A * SCC-A 找出 low FSC, SSC，小撇步是圈出 FSC-A 小至大但 SSC-A 不會太多的，可以抓 45 度角線與以下分到 debris）、排除兩顆或多顆排在一起的（FSC-A * FSC-H 圈 45 度角~30 度角線上的，捨棄線之下的 duplets）
惡性腫瘤細胞可能會有表現錯亂（aberrant expression）的狀況，因此確認 lineage 最好用兩種或以上個 CD markers 來看，比如說 T cell 就要看 CD3 與 CD7，其他 pan T cell markers 也要看，像是 CD2、CD5。
病人用藥史需要整理，用 steroids 的人會使更多細胞分化，CD34 陽性的細胞可能會減少，用 targeted agents 的病人可能會有 antigen escape 的問題，像是 Rituximab 打完後的 B cell lymphoma 的 CD20 參考性會降低，需要靠其他 B cell markers 輔助判斷。
單管分析完才會將資料合併起來。
心得
慢慢接觸流式細胞儀，才知道韓醫師說「這是個超深的坑」的意思。以上的整理只是簡單的速記，只有皮毛，還有許多要學的地方。只是，每個領域都有第一步。唯有第一步，才有之後越走越長遠的步。