流式細胞儀在血液疾病的應用：入門

感謝韓紹民醫師與2020年籌辦工作坊，也感謝林口長庚施宣任醫師的教學，以下為教學與我自己讀書的心得筆記整理。

英文名 Flow Cytometry in Hematological Diseases : An Introduction

在 EuroFlow 引入台灣後，大大地改變了流式細胞儀在台灣臨床的運用。EuroFlow 的資料公佈在網路上，任何人都可以查得到，以下是它的網頁。

https://euroflow.org/protocols/

另外是線上課程可以在 International Society for Advancement of Cytometry (ISAC) 網站 CYTO University 找到。

篩檢流程

如果我們抽了一管血，或是淋巴結檢體，骨髓、胸水、腦脊髓液等體液，送到流式細胞儀的檢驗單位，會走什麼樣的流程。送檢加做要在 48 小時之內，以免 viability 影響判讀結果。

如果懷疑急性血癌的話，會送 ALOT (acute leukemia orientation tube)，懷疑淋巴瘤的話，會送 LST (lymphoma screening tube)，而懷疑漿細胞病變多發性骨髓瘤的話，會送 PCST (Plasma Cell Screening Tube)。

Diagnosis, classification and monitoring of hematological malignancies Composition and technical information on reagents; Version 1.11 (November 2023)

ALOT 會依 Myeloid, T, B cell markers 再分出 AML/MDS, T-ALL, B-ALL。而 LST 則可以分出 B-CLPD (B cell lymphoproliferative disorders)、T-CLPD (T cell lymphoproliferative disorders)，與 NK-CLPD (NK cell lymphoproliferative disorders)。我們會用 lineage markers 來判斷接下來要做 Myeloid、B cell、T cell，還是 NK。

除了 CD 幾負責什麼功能要有印象外，也要記得它們的位置。像是 CD3 分 sCD3 主要在成熟T細胞，而 cyCD3 只要是 T 細胞無論成熟與否都有。

常見參數與名稱

• CD：全名叫 cluster of differentiation，細胞表面的蛋白質常見的會被賦予不同編號，比如說 PD-1 是 CD279、CTLA4 是 CD152、CCR7 是 CD197、Leukocyte Antigen (LCA) 是 CD45。

• 除了看到「CD幾」外，還會看到後面接著一串，像是 FITC、PE、PB、APC、APCH7、KrO、PacB、PacO、PerCP55 等，這些是螢光染劑 Dye conjugates (fluorochrome) 。

• Forward scatter (FS)：大小會分 height (FSC-H) 與 area (FSC-A)。

• side measure side scatter (SS) : 看細胞顆粒。

• Automated population separator (APS)：如果把一個 marker (e.g., CD8) 當作一維的話，多維的分佈投影到二維平面，就是 APS 呈現的原理，有點像 UMap 與 tSNE。原理參見此篇。加入的參數越多，分得越好，如果加入 time 這個參與就會排成一條條的直線（可以不用XD）。開啟 APS 可以大概看出有幾群細胞。

實用的操作原則

• 先對各血球成熟 (differentiation, maturation) 會出現哪些 CD markers 有概念，才會知道目標血球可能處於哪一個階段。比較可以用理解而不是死背硬記。

• 機器可以幫忙自動分群 (automated clustering)，之後再用手動修正。有 database 可以參考而且可以自動產出報告，但是要錢，然後操作流程必須要完全參照 SOP。

• 圈選（Gating）目標細胞除了目標的 CD markers（例：T cell lymphoma 要抓出 CD3、CD7、CD4/8），還是要排除掉非血球細胞（從 CD45 * SSC-A 找出 CD45 negative 分到非血球）、排除死細胞（FSC-A * SCC-A 找出 low FSC, SSC，小撇步是圈出 FSC-A 小至大但 SSC-A 不會太多的，可以抓 45 度角線與以下分到 debris）、排除兩顆或多顆排在一起的（FSC-A * FSC-H 圈 45 度角~30 度角線上的，捨棄線之下的 duplets）

• 惡性腫瘤細胞可能會有表現錯亂（aberrant expression）的狀況，因此確認 lineage 最好用兩種或以上個 CD markers 來看，比如說 T cell 就要看 CD3 與 CD7，其他 pan T cell markers 也要看，像是 CD2、CD5。

• 病人用藥史需要整理，用 steroids 的人會使更多細胞分化，CD34 陽性的細胞可能會減少，用 targeted agents 的病人可能會有 antigen escape 的問題，像是 Rituximab 打完後的 B cell lymphoma 的 CD20 參考性會降低，需要靠其他 B cell markers 輔助判斷。

• 單管分析完才會將資料合併起來。

心得

慢慢接觸流式細胞儀，才知道韓醫師說「這是個超深的坑」的意思。以上的整理只是簡單的速記，只有皮毛，還有許多要學的地方。只是，每個領域都有第一步。唯有第一步，才有之後越走越長遠的步。